《基因工程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝課件》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《基因工程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝課件（149頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),,,?,?#?,第四講 基因工程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝,,藥用蛋白質(zhì)的合成復(fù)雜，要有精確折疊的空間結(jié)構(gòu)，要有糖基化，才能使藥物發(fā)揮真正的功能。細(xì)菌和酵母等產(chǎn)品要么是包涵體，要么難以糖基化功能修飾。動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)有功能的蛋白質(zhì)，大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞特別是人源細(xì)胞的培養(yǎng)在藥物生產(chǎn)中的位置會(huì)越來越重要。,人畜病毒疫苗:口蹄疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病和脊髓灰質(zhì)炎、乙肝疫苗。,干擾素、單克隆抗體、重組基因工程產(chǎn)品。,組織型血纖蛋白溶酶原激活劑、免疫珠蛋白G、M、尿激酶、人生長(zhǎng)因子等。,,?,第四講 基因工程動(dòng)物細(xì)胞

2、培養(yǎng)制藥工藝?,1,第一節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞制藥的表達(dá)系統(tǒng)與特征,,昆蟲系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)，最成功、重要表達(dá)活性外源蛋白的有效系統(tǒng)，應(yīng)用于藥物蛋白質(zhì)的表達(dá)。,一、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與特征,1. 動(dòng)物細(xì)胞的特征,細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì),和細(xì)胞核,沒有細(xì)胞壁。,亞細(xì)胞器，功能獨(dú)特。,,?,第一節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞制藥的表達(dá)系統(tǒng)與特征?,2,2. 動(dòng)物細(xì)胞代謝,動(dòng)物細(xì)胞的不同代謝途徑及其相應(yīng)的酶體系定位于特定的亞細(xì)胞區(qū)域。通過胞內(nèi)運(yùn)輸（囊泡包裹）實(shí)現(xiàn)區(qū)域之間的物質(zhì)、信息和能量流動(dòng)，通過穿梭實(shí)現(xiàn)不同代謝途徑之間的交換。,在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，葡萄糖和谷氨酰胺提供能量并作為合成代謝的前體，因此動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)具有一定的靈活性。

3、,葡萄糖受限可增加谷氨酰胺的消耗得以補(bǔ)償，反之亦然。谷氨酰胺是動(dòng)物細(xì)胞的氮源，谷氨酰胺受限時(shí)，可增加其他氨基酸的消耗得以補(bǔ)償。,,,?,2. 動(dòng)物細(xì)胞代謝?,3,糖代謝特點(diǎn)：,動(dòng)物細(xì)胞吸收葡萄糖后，進(jìn)行糖酵解，大部分葡萄糖分解為丙酮酸，進(jìn)一步被還原為乳酸，乳酸分泌到胞外并在培養(yǎng)液中積累。,丙酮酸還可轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶,A,，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，徹底氧化產(chǎn)生,CO,2,和水。小部分（,4,％～,8,％）葡萄糖進(jìn)入戊糖磷酸途徑，把葡萄糖轉(zhuǎn)化為,4,、,5,、,7,碳糖和還原力,NADPH,，,5,碳糖用于核酸合成，其他中間產(chǎn)物進(jìn)入脂肪酸代謝、核酸代謝和氨基酸代謝。,葡萄糖代謝旺盛，會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸，對(duì)細(xì)胞

4、產(chǎn)生毒性。,,,?,糖代謝特點(diǎn)：?,4,氨基酸代謝特點(diǎn)：,吸收谷氨酰胺后，進(jìn)入氨基酸代謝途徑，通過脫氨、轉(zhuǎn)氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。,大多數(shù)谷氨酰胺在脫氨酶催化下，生成谷氨酸，并釋放氨，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。小部分谷氨酰胺通過轉(zhuǎn)氨生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代謝的前體。,谷氨酸還原酶把谷氨酸轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物α,-,酮戊二酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，為細(xì)胞提供能量。所以谷氨酰胺在細(xì)胞能量代謝中具有重要作用。谷氨酰胺與丙酮酸和草酰乙酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用，生成丙氨酸和天門冬氨酸，丙氨酸可進(jìn)入培養(yǎng)液并積累。在快速生長(zhǎng)的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)體系，轉(zhuǎn)氨作用是主要的代謝途徑。,,,?,氨基酸代謝特點(diǎn)：?,5,不同的培養(yǎng)條

5、件，葡萄糖和谷氨酰胺代謝重疊于丙酮酸。在正常細(xì)胞系中，丙酮酸羧化產(chǎn)生草酰乙酸，而草酰乙酸來源于谷氨酰胺。,在連續(xù)細(xì)胞系中，沒有這種流動(dòng)。能量是以,ATP,和,NADPH,的形式提供，來源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二種細(xì)胞系對(duì)各個(gè)代謝途徑的貢獻(xiàn)和所起的作用不同。,常流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整個(gè)代謝過程，避免有毒廢物積累。,,,?,不同的培養(yǎng)條件，葡萄糖和谷氨酰胺代謝重疊于丙酮酸。在正常細(xì)胞,6,3. 蛋白質(zhì)糖基化,蛋白質(zhì)合成是以mRNA為模板，在核糖體上完成。而蛋白質(zhì)的糖基化無(wú)需模板指導(dǎo)，因此糖蛋白的寡糖結(jié)構(gòu)容易發(fā)生變化。,糖蛋白的單糖單元:α-D-葡萄糖、α-D-半乳糖、α-D-甘露糖、α-D-

6、木糖、α-D-巖藻糖、N-乙酰-α-D-葡萄糖胺、N-乙酰-α-D-半乳糖胺和α-N-乙酰神經(jīng)氨酸（或唾液酸）。,糖基化類型：寡糖基以共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)的氮原子結(jié)合為N-糖基化，或與氧原子結(jié)合為O-糖基化。這兩種糖基化的位點(diǎn)和數(shù)量及糖的種類都不同。,,?,3. 蛋白質(zhì)糖基化?,7,N-糖基化：聚糖部分連接在天門冬酰胺的氨基上，其模體的保守序列為Asn-X-Thr/Ser (X為除脯氨酸以外的任意氨基酸)。如果X為Trp、Asp、Glu和Leu，對(duì)糖基化有負(fù)影響，而第三位Thr能增強(qiáng)糖基化。,N-糖基化分為高甘露糖型、復(fù)合型和雜合型三種類型，共同核心是3個(gè)甘露糖和2個(gè)N-乙酰葡萄糖胺組成的5糖（Ma

7、n,3,GluNAc,2,），其他糖形成支鏈。,高甘露糖型的支鏈為甘露聚糖（5～9聚體），無(wú)其他糖。,復(fù)合型含有2個(gè)以上支鏈，如乙酰半乳糖胺、果糖和唾液酸等。,雜合型至少含有一條復(fù)合糖鏈，另一個(gè)鏈含有甘露糖。,,?,N-糖基化：聚糖部分連接在天門冬酰胺的氨基上，其模體的保守序,8,O-聚糖連接在Thr/Ser的羥基上，還沒有發(fā)現(xiàn)保守序列。,O-聚糖有四種不同的核心結(jié)構(gòu)，都含有N-乙酰半乳糖胺基，糖基化會(huì)影響蛋白質(zhì)的局部構(gòu)象。,O-糖基化比較小，一般為1～6個(gè)寡聚糖，但比N-糖基化變化更大。,O-糖基化只在高爾基體上進(jìn)行，糖基單元有木糖、葡萄糖。,,,?,O-聚糖連接在Thr/Ser的羥基上，還

8、沒有發(fā)現(xiàn)保守序列。?,9,糖基化磷脂酰肌醇錨著點(diǎn)：它在膜與蛋白質(zhì)之間形成穩(wěn)定的相互作用，都具有相同的核心結(jié)構(gòu)：膽胺-PO,4,-Man,2,-GlcHN,2,-肌醇-PO,4,-脂。,膽胺形成膜內(nèi)蛋白的橋，而肌醇在膜內(nèi)。,在細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白時(shí)，磷脂酶C可切割此類蛋白，有利于純化。,,,?,糖基化磷脂酰肌醇錨著點(diǎn)：它在膜與蛋白質(zhì)之間形成穩(wěn)定的相互作用,10,細(xì)胞特異性糖基化途徑——淋巴細(xì)胞中進(jìn)行，它不依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。,IgG的糖基化，等分GlcNAc殘基連接在核心甘露糖上，該糖基化在抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性中起重要作用。,IgG蛋白的鉸鏈區(qū)，富含Ser、Thr和Pro，5個(gè)Ser

9、全部糖基化。,促黃體激素、促甲狀腺素等的硫酸化只能在垂體中發(fā)生。,,,?,細(xì)胞特異性糖基化途徑——淋巴細(xì)胞中進(jìn)行，它不依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高,11,盡管哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有細(xì)胞內(nèi)的糖基化裝置，但不同細(xì)胞系，糖基化特征不同。,鼠和豬細(xì)胞傾向于添加乙酰果糖而不是乙酰唾液酸，在鼠雜交瘤或人鼠雜交瘤生產(chǎn)的抗體中，乙酰果糖占優(yōu)勢(shì)。,CHO,細(xì)胞不能合成等分,N-,乙酰葡萄糖胺，而鼠細(xì)胞系卻能形成半乳糖末端，對(duì)人有免疫原性。,要根據(jù)糖基化的結(jié)構(gòu)，選擇適宜的細(xì)胞系。,,,?,盡管哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有細(xì)胞內(nèi)的糖基化裝置，但不同細(xì)胞系，糖基化,12,細(xì)胞系,,Fuc,,Gal,,唾液酸,,α1,6,,α1,3 Fuc,α1,

10、3Gal,,SO,4,-GalNAc,α2,3,,,α2,6,糖基化,等分GluNAc,BHK,,++,,0,,+,,0,,++,,0,,-,,0,,CHO,,++,,-,,0,,0,,++,,0,,+,,0,,鼠雜交瘤,,++,,0,,++,,0,,++,,0,,+++,,0,,C127,,++,,0,,++,,++,,++,,++,,+++,,0,,J558L,,++,,0,,++,,-,,++,,++,,+++,,0,,人淋巴細(xì)胞,++,,0,,0,,0,,+,,+,,0,,++,,人垂體,,++,,0,,0,,+++,,+,,+,,0,,++,,Namalwa,,++,,0,,0,,0

11、,,++,,++,,-,,-,,人鼠雜交瘤,++,,0,,0,,0,,+,,+,,+,,0,,,?,細(xì)胞系Fuc Gal唾液酸α1,6 α1,3 Fucα1,3,13,2. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),基因工程哺乳動(dòng)物細(xì)胞系：失去分化能力的無(wú)限生長(zhǎng)細(xì)胞系，即永久性細(xì)胞。表達(dá)的蛋白質(zhì)能正確加工、修飾并折疊形成具有生物活性的功能分子，接近或類似天然產(chǎn)物。,糖基化等修飾是糖蛋白行使功能所必需的，而且對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量有影響，如生物活性、穩(wěn)定性、免疫原性等。原核細(xì)胞表達(dá)的EPO無(wú)糖基化，在體內(nèi)表現(xiàn)無(wú)活性。原核表達(dá)的GM－CSF雖有活性，但在體內(nèi)產(chǎn)生抗體。,動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)液，容易分離純化。約有70％批準(zhǔn)的

12、蛋白質(zhì)藥物由哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)制造，而且數(shù)目還在不斷增加。,,?,2. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)?,14,表達(dá)系統(tǒng),,O-糖基化,,寡聚甘露糖,高甘露糖,復(fù)合體,,大腸桿菌,,0,,0,,0,,0,,釀酒酵母,,＋＋,,0,,＋＋＋＋,,－,,昆蟲Sf9,,＋＋,,＋＋＋＋,,0,,－,,倉(cāng)鼠CHO,,＋＋,,＋＋,,0,,＋＋,,倉(cāng)鼠BHK,,＋＋,,＋＋,,0,,＋＋,,鼠雜交瘤,,＋＋,,＋＋,,0,,＋＋,,鼠骨髓瘤,,＋＋,,＋＋,,0,,＋＋,,C127,,＋＋,,＋＋,,0,,＋＋,,J558L,,＋＋,,－,,0,,＋＋,,人淋巴細(xì)胞,,＋＋,,0,,0,,＋,,Namalwa,

13、,＋＋,,＋＋,,0,,＋＋,,人鼠雜交瘤,,－,,＋＋,,0,,＋＋,,,?,表達(dá)系統(tǒng)O-糖基化寡聚甘露糖高甘露糖復(fù)合體大腸桿菌0000釀,15,,,大腸桿菌,,酵母,,哺乳動(dòng)物細(xì)胞,,產(chǎn)物濃度,,高,,高,,低,,分子量,,低,,高,,高,,二硫鍵,,有限,,不受限制,,不受限制,,分泌,,無(wú),,有或無(wú),,有,,形式,,包涵體,,單鏈，天然,,單鏈，天然,,折疊,,不正確,,正確,,正確,,糖基化,,無(wú),,可能,,完全,,逆轉(zhuǎn)錄病毒,,無(wú),,無(wú),,可能,,熱原,,可能,,無(wú),,無(wú),,培養(yǎng)特點(diǎn),,容易,,容易,,較難，成本高,,分離純化,,復(fù)雜,,復(fù)雜,,簡(jiǎn)單,,,?,大腸桿菌酵母哺乳動(dòng)物細(xì)

14、胞產(chǎn)物濃度高高低分子量低高高二硫鍵有,16,細(xì)胞類型,,表達(dá)水平（μg/ml）,,猴CV1,,1～10,,猴CV1,,0.05,,猴COS,,1,,小鼠成纖維細(xì)胞C127,,1～5,,小鼠成纖維細(xì)胞3T3,,0.1～0.5,,CHO（dhfr,－,）,,0.01~0.05,,CHO（dhfr,－,）,,10,,,?,細(xì)胞類型表達(dá)水平（μg/ml）猴CV11～10猴CV10.0,17,動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的不足是細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，生產(chǎn)效率較低，產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他表達(dá)系統(tǒng)。,骨髓細(xì)胞MPG－11生產(chǎn)IgG的能力為5pg/(細(xì)胞.分鐘)，10L反應(yīng)器，密度為107/ml，生產(chǎn)能力不到1g/d。,連續(xù)細(xì)胞系增

15、加了生長(zhǎng)和代謝速率，但同時(shí)導(dǎo)致了副產(chǎn)物的增加。,動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)條件要求苛刻和敏感，對(duì)溫度、pH、滲透壓、剪切力等忍受能力差。培養(yǎng)基要求高，需要添加氨基酸、維生素等，往往需要附加血清，提供生長(zhǎng)因子，費(fèi)用較高。同時(shí)可能有潛在的致病因子、免疫原性存在。,表達(dá)載體的改進(jìn)和宿主細(xì)胞的改造是動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的研發(fā)重要內(nèi)容。,,?,動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的不足是細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，生產(chǎn)效率較低，產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn),18,3. 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與特征,表達(dá)載體為昆蟲病毒，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，表達(dá)出目標(biāo)蛋白質(zhì)。昆蟲病毒主要有桿狀病毒科核多角體病毒。,苜蓿尺蠖核多角體病毒－秋黏蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，家蠶核多角體病毒－家蠶幼蟲表達(dá)系統(tǒng)。,Micro

16、－Gene Sys公司表達(dá)艾滋病基因工程疫苗，隨后豬生長(zhǎng)素、CD4膜蛋白及瘧疾疫苗、雞新城病毒疫苗、血吸蟲GST疫苗、乙肝表面抗原、重組人GM－CSF等。日本批準(zhǔn)用家蠶系統(tǒng)生產(chǎn)干擾素已上市。生物試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品大多用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)。,至少有600多種昆蟲可以作為宿主，每年有數(shù)百個(gè)基因利用昆蟲系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，越來越成為非常有用的表達(dá)宿主。,,?,3. 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與特征?,19,優(yōu)點(diǎn),1）安全：桿狀病毒無(wú)致病性，產(chǎn)品安全性受FDA認(rèn)可。,2）易飼養(yǎng)：家蠶喪失了野外生存能力，飼養(yǎng)，發(fā)育快，,3）高量表達(dá)：用強(qiáng)啟動(dòng)子，外源基因可超量表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物在昆蟲細(xì)胞內(nèi)能結(jié)晶，對(duì)產(chǎn)物純化非常有意義。,4）高效

17、表達(dá)：可容納較大的外源基因（12kb），表達(dá)數(shù)個(gè)外源基因，并且正確裝配成有功能的分子。如表達(dá)抗體的重鏈和輕鏈，自主裝配成有功能的抗體。,5）翻譯后的加工：昆蟲細(xì)胞能進(jìn)行一系列翻譯后的加工，包括糖基化、脂肪酸酰基化、磷酸化、氨基酸的乙?；?、氨?；?，大部分產(chǎn)物顯示出良好的活性。,,?,優(yōu)點(diǎn)?,20,缺點(diǎn)：,1,）重組率低，篩選困難，周期長(zhǎng)，需要,4,－,10,天。,2,）外源基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)染的晚期，大約在,20h,后起始基因表達(dá)，在,72,－,94h,細(xì)胞裂解死亡，基因表達(dá)時(shí)間約,30,－,50h,，高水平表達(dá)不連續(xù)且時(shí)間短，這對(duì)表達(dá)不利。,3,）昆蟲細(xì)胞糖基化等加工途徑與哺乳動(dòng)物細(xì)胞不完全相同

18、，它不提供復(fù)雜的,N,糖基化，如添加半乳糖和唾液酸殘基，有可能造成溶解性、穩(wěn)定性、免疫性等變化。表達(dá)水平非常高，加工裝備跟不上，蛋白質(zhì)修飾效率可能不高。,研究開發(fā)的主要方向：有效的病毒表達(dá)載體；,決定基因表達(dá)時(shí)期啟動(dòng)子，無(wú)血清培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞系。,,?,缺點(diǎn)：?,21,第二節(jié) 基因工程動(dòng)物細(xì)胞系的構(gòu)建,,,構(gòu)建高效表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞,篩選鑒定,獲得生產(chǎn)用工程化細(xì)胞系,,,,?,第二節(jié) 基因工程動(dòng)物細(xì)胞系的構(gòu)建 ?,22,動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體：病毒載體，質(zhì)粒載體。,病毒載體：,逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒等載體，對(duì)原始病毒改造而來。,同源重組構(gòu)建腺病毒載體，在靜止期轉(zhuǎn)染細(xì)胞，表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)

19、。,痘病毒載體可插入,25,～,40 kb,外源基因，甚至是多個(gè)基因。無(wú)感染性和致癌性，可用于構(gòu)建基因工程疫苗。,美國(guó),Genentech,公司已用,SV40,載體生產(chǎn)乙肝疫苗，其他載體可用于基因治療。,,,?,動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體：病毒載體，質(zhì)粒載體。?,23,質(zhì)粒載體：,微生物的質(zhì)粒載體類似，一般是穿梭質(zhì)粒，具有兩個(gè)復(fù)制子和抗性篩選標(biāo)記基因。,大腸桿菌的復(fù)制子，細(xì)菌中繁殖。,抗生素抗性標(biāo)記，原核細(xì)胞篩選。,動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)制子，,在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。,還有絲狀噬菌體復(fù)制子。,,,?,質(zhì)粒載體：?,24,啟動(dòng)子序列：含有RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)，以便有效轉(zhuǎn)錄。TATA盒，確定起始位置；GG盒，

20、影響轉(zhuǎn)錄頻率。,來源于病毒、動(dòng)物基因和噬菌體的啟動(dòng)子。,動(dòng)物病毒啟動(dòng)子：逆轉(zhuǎn)錄病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTRS）、SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子、腺病毒的晚期啟動(dòng)子、人巨噬病毒（CMV）立即早期基因啟動(dòng)子。,動(dòng)物基因的啟動(dòng)子：轉(zhuǎn)錄因子EF-1α啟動(dòng)子、泛素蛋白啟動(dòng)子、β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、干擾素-α啟動(dòng)子、IgG啟動(dòng)子、鼠金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子等。,噬菌體T7啟動(dòng)子比動(dòng)物基因啟動(dòng)子表達(dá)水平高。,,?,啟動(dòng)子序列：含有RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)，以便有效轉(zhuǎn)錄。T,25,PolyA信號(hào)序列：保持mRNA的穩(wěn)定性，防止降解，保證了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工和正確性，但序列不宜太長(zhǎng)，避免能量過度消耗。添加PolyA信號(hào)

21、和5′端轉(zhuǎn)錄暫停位點(diǎn)，可以減少上游序列轉(zhuǎn)錄通讀造成的背景。,牛生長(zhǎng)素（BGH）基因的PolyA信號(hào)比SV40 PolyA更強(qiáng)，常用于高效表達(dá)載體中。,終止序列：AAUAAA或連續(xù)的終止密碼UGA、UAA和UAG，能防止轉(zhuǎn)錄通讀，使轉(zhuǎn)錄在正確的位點(diǎn)結(jié)束。,在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游或下游使用相同類型的增強(qiáng)子，有利于提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平。,,?,PolyA信號(hào)序列：保持mRNA的穩(wěn)定性，防止降解，保證了轉(zhuǎn),26,雙順反子表達(dá)載體：,兩個(gè)基因在同一啟動(dòng)子控制之下，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)使同一,mRNA,中的第二個(gè)基因得到翻譯。將,dhfr,與目標(biāo)基因串連，,dhfr,的,cDNA,插入內(nèi)含子中，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被剪切

22、，翻譯不出蛋白質(zhì)，而目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物得到翻譯。,順反子在多亞基蛋白的偶聯(lián)表達(dá)及其控制策略等方面有廣泛應(yīng)用前景。,使篩選容易，而且能高效表達(dá)。,,?,雙順反子表達(dá)載體：?,27,選擇適宜的啟動(dòng)子，可實(shí)現(xiàn)定向表達(dá)。,CMV啟動(dòng)子和人EF-1α啟動(dòng)子，可實(shí)現(xiàn)同一載體上的二個(gè)基因的獨(dú)立表達(dá)。,組織特異性啟動(dòng)子：如鼠、山羊酪蛋白啟動(dòng)子，可使基因主要在乳腺中表達(dá)。,N端設(shè)計(jì)分泌信號(hào)肽：如Ig κ鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)之間序列，使外源基因的表達(dá)產(chǎn)物向胞外分泌。,C端設(shè)計(jì)跨膜錨定序列：可使外源蛋白展示在細(xì)胞表面。,亞細(xì)胞定位信號(hào)肽：目標(biāo)基因產(chǎn)物將轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞質(zhì)中，這對(duì)基因的功能研究非常合適

23、。,,?,選擇適宜的啟動(dòng)子，可實(shí)現(xiàn)定向表達(dá)。?,28,基因的擴(kuò)增系統(tǒng)：,在逐漸提高選擇壓的情況下，使選擇標(biāo)記基因拷貝數(shù)增加，并可連帶其兩側(cè)序列一起擴(kuò)增，從而提高表達(dá)基因水平。,最常用二氫葉酸二氫葉酸還原酶（,DHFR,）基因系統(tǒng)和谷氨酰氨合成酶（,GS,）基因系統(tǒng)。,氨甲喋呤基因與目標(biāo)基因重組，氨甲喋呤使,dhfr,基因與目標(biāo)基因大量增加，達(dá)到數(shù)千拷貝。,硫胺蛋氨酸使,GS,系統(tǒng)的基因得到大量擴(kuò)增。,,?,基因的擴(kuò)增系統(tǒng)：?,29,二、受體細(xì)胞,1．人源細(xì)胞株系,Namalwa：類淋巴母細(xì)胞，非整體核型。表達(dá)IgM，懸浮生長(zhǎng)。外源基因的表達(dá)水平較高，可用無(wú)血清培養(yǎng)基高密度培養(yǎng)，已成功地表達(dá)了r

24、hEPO、rhG-CSF、tPA等。英國(guó)Wellcome公司用Namalwa細(xì)胞的反應(yīng)器達(dá)8000L，用Sendai病毒誘導(dǎo)，大規(guī)模生產(chǎn)α干擾素，并批準(zhǔn)上市。,WI-38：二倍體成纖維細(xì)胞系，2n=46，第一個(gè)被用于制備疫苗。貼壁生長(zhǎng)，對(duì)很多病毒敏感，廣泛用于疫苗生產(chǎn)。,MRC-5：二倍體成纖維細(xì)胞系，但生長(zhǎng)較WI-38快，對(duì)逆境有一定抗性也用于制備疫苗。,,?,二、受體細(xì)胞?,30,2．哺乳動(dòng)物細(xì)胞株系,CHO細(xì)胞：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢中分離的上皮樣細(xì)胞系，貼壁型生長(zhǎng)，是目前使用最為普遍和成熟的表達(dá)糖基化蛋白藥物的宿主細(xì)胞。核型為亞二倍體，分泌表達(dá)外源蛋白，而內(nèi)源蛋白分泌很少。貼壁型生長(zhǎng)細(xì)胞，但可進(jìn)

25、行懸浮培養(yǎng)，對(duì)剪切力和滲透壓有較高的忍受能力。蛋白質(zhì)翻譯后的修飾準(zhǔn)確，表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和生物活性接近天然。,有多種衍生突變株應(yīng)用于藥物的生產(chǎn)，培養(yǎng)時(shí)需要添加脯氨酸。二氫葉酸還原酶缺陷株表達(dá)的藥物有tPA、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子Ⅷ、DNA酶Ⅰ，已上市。,使用氨甲酰喋呤，增加外源基因的拷貝數(shù)，提高蛋白質(zhì)表達(dá)水平。,,?,2．哺乳動(dòng)物細(xì)胞株系?,31,BHK－21：幼倉(cāng)鼠腎臟中分離的成纖維樣細(xì)胞，非整倍體。用于增殖病毒、制備疫苗和重組蛋白。BHK-21表達(dá)的重組凝血因子Ⅷ已被獲準(zhǔn)上市。,C127：從小鼠乳腺腫瘤中分離獲得的上皮樣細(xì)胞，貼壁型生長(zhǎng)。C127細(xì)胞系已表達(dá)多種外源

26、基因，其中EPO的水平達(dá)10 mg/L，生產(chǎn)rhGH已被批準(zhǔn)上市。,3T3,：,HIN Swiss,小鼠胚胎培養(yǎng)物中分離建立的連續(xù)細(xì)胞系，能大量表達(dá)外源蛋白，廣泛用于藥物毒理學(xué)研究。,骨髓瘤細(xì)胞：,J558L,是小鼠,BALB/c,骨髓瘤細(xì)胞，分泌,IgA,，用于轉(zhuǎn)染研究。,NSO,和,SP2/O,－,Ag14,不分泌,Ig,，與淋巴細(xì)胞融合篩選雜交瘤，分泌制備特異性抗體。,,,?,BHK－21：幼倉(cāng)鼠腎臟中分離的成纖維樣細(xì)胞，非整倍體。用于,32,雜交瘤細(xì)胞：從小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞中分離獲得雜交瘤細(xì)胞系，能在無(wú)血清培養(yǎng)基中高密度懸浮生長(zhǎng)，容易轉(zhuǎn)染和生長(zhǎng)，能進(jìn)行糖基化等加工修飾，大

27、量分泌和高效表達(dá)。很多雜交瘤細(xì)胞系用于抗體的制備。,Vero：從成年非洲綠猴腎中分離獲得的貼壁型成纖維細(xì)胞，多倍體核型，能適應(yīng)灌流操作，進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。已有突變細(xì)胞系能用無(wú)血清培養(yǎng)。最為常用Vero E6增殖多種病毒，如脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒、乙腦病毒等，生產(chǎn)病毒性疫苗，已被批準(zhǔn)用于人體。也可作為轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，用于表達(dá)外源基因的蛋白質(zhì)藥物和病毒的檢測(cè)。,COS,：是從,SV40 DNA,轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎細(xì)胞,CV1,中分離得到的，廣泛用于外源基因瞬時(shí)表達(dá)的研究。,GH3用于生長(zhǎng)激素研究，293細(xì)胞系用于基因治療的研究。,,?,雜交瘤細(xì)胞：從小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞中分離獲得雜交,33,3

28、．昆蟲細(xì)胞株系,Sf21：從秋粘蟲卵巢細(xì)胞中分離得到，細(xì)胞較大，容易放大，高效表達(dá)外源基因。,Sf9：從秋粘蟲的卵巢細(xì)胞（SF21）中分離得到，是最常用的昆蟲表達(dá)細(xì)胞。對(duì)桿狀病毒高度敏感，生長(zhǎng)快，能高效表達(dá)外源基因?？箼C(jī)械剪切，能在無(wú)血清培養(yǎng)基的攪拌反應(yīng)器中生長(zhǎng)。,TN-5B1-4：從粉紋夜蛾卵細(xì)胞勻漿中分離得到，無(wú)血清培養(yǎng)，快速倍增。分泌表達(dá)重組蛋白的能力比Sf9細(xì)胞系高20多倍，能適應(yīng)懸浮培養(yǎng)。,,,?,3．昆蟲細(xì)胞株系?,34,三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染（是將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞的技術(shù)通用名稱?；?qū)胝婧思?xì)胞的方法很多，主要有化學(xué)轉(zhuǎn)染、物理轉(zhuǎn)染和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。,方法,,表達(dá)類型,,毒性,

29、,細(xì)胞類型,,特點(diǎn),,基因槍,,瞬時(shí)，穩(wěn)定,,無(wú),,多種細(xì)胞組織，器官,,有效，儀器操作,,顯微注射,,瞬時(shí)，穩(wěn)定,,無(wú),,多種細(xì)胞,,有效，技術(shù)難度大,,電穿孔,,瞬時(shí)，穩(wěn)定,,無(wú),,多種細(xì)胞,,有效，儀器操作,,沖擊波,,瞬時(shí)，穩(wěn)定,,無(wú),,多種細(xì)胞，局部組織,,簡(jiǎn)單有效，儀器操作,,,?,三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法表達(dá)類型毒性細(xì)胞類型特點(diǎn)基因槍瞬時(shí)，穩(wěn)定無(wú)多,35,方法,,表達(dá)類型,,毒性,,細(xì)胞類型,,特點(diǎn),,逆轉(zhuǎn)錄病毒,,瞬時(shí)，穩(wěn)定,,無(wú),,對(duì)應(yīng)的宿主細(xì)胞,,有效,,原生質(zhì)體融合,,瞬時(shí)，穩(wěn)定,,無(wú),,懸浮細(xì)胞,,技術(shù)復(fù)雜,,生物轉(zhuǎn)染特點(diǎn),,?,方法表達(dá)類型毒性細(xì)胞類型特點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒瞬時(shí)，穩(wěn)定

30、無(wú)對(duì)應(yīng)的宿主,36,化學(xué)轉(zhuǎn)染是最常用的轉(zhuǎn)染方法。,其基本原理是磷酸鈣、二乙氨乙基（,DEAE,）－葡聚糖（,dextran,）和陽(yáng)離子樹脂與核酸形成復(fù)合物，附著于細(xì)胞表面，通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。,磷酸鈣與,DNA,形成不溶性沉淀，帶正電荷的,DEAE,－葡聚糖與帶負(fù)電荷的,DNA,磷酸基團(tuán)結(jié)合，陽(yáng)離子樹脂包裹,DNA,形成脂質(zhì)體。,滲透性休克和,DMSO,等化學(xué)試劑能促進(jìn),DNA,進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染試劑盒商業(yè)化供應(yīng)，特別是脂質(zhì)體材料的轉(zhuǎn)染試劑。,影響因素：細(xì)胞培養(yǎng)物的密度、,DNA,的大小、純度與用量、化學(xué)試劑的用量與處理時(shí)間、促進(jìn)劑的使用等。,,?,化學(xué)轉(zhuǎn)染是最常用的轉(zhuǎn)染方法。?,37,方

31、法,,表達(dá)類型,,毒性,,細(xì)胞類型,,特點(diǎn),,磷酸鈣,,瞬時(shí)、穩(wěn)定,,無(wú),,貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞,,簡(jiǎn)單,,DEAE-葡聚糖,,瞬時(shí),,有,,CV1，COS,,簡(jiǎn)單,,陽(yáng)離子樹脂,,瞬時(shí)、穩(wěn)定,,有或無(wú),,貼壁、原代懸浮細(xì)胞,,簡(jiǎn)單，有效,,化學(xué)轉(zhuǎn)染的特點(diǎn),,?,方法表達(dá)類型毒性細(xì)胞類型特點(diǎn)磷酸鈣瞬時(shí)、穩(wěn)定無(wú)貼壁細(xì)胞，懸浮,38,四、轉(zhuǎn)染體篩選與分離,轉(zhuǎn)染后1～6天收獲細(xì)胞，進(jìn)行核酸分子雜交或蛋白質(zhì)雜交，檢測(cè)外源基因的瞬時(shí)表達(dá)。,為了獲得穩(wěn)定整合的細(xì)胞系，先在非選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～48小時(shí)，讓細(xì)胞倍增1～2代，使轉(zhuǎn)染DNA表達(dá)。再按1：15比例轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基上，每2～4天更換培養(yǎng)基，持續(xù)

32、2～3周，促進(jìn)抗性細(xì)胞生長(zhǎng)，清除死細(xì)胞殘骸，最后得到獨(dú)立的克隆。,在轉(zhuǎn)染中大約有萬(wàn)分之一的細(xì)胞將穩(wěn)定整合外源基因，因此需要顯性選擇標(biāo)記來分離轉(zhuǎn)染細(xì)胞。,哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)記，使用與之相對(duì)應(yīng)的選擇劑。,,,?,四、轉(zhuǎn)染體篩選與分離?,39,選擇劑,,基因,,使用濃度,,氨甲喋呤,,dhfr,－,,0.01～300 μmol/L,,氨喋呤,,tk,＋,,0.4 μmol/L,,5-溴脫氧尿苷,,tk,－,,30 μg/ml,,G418, Zeocin,,neo,,100～800 μg/ml,,潮霉素B,,hyg,,10～400 μg/ml,,殺瘟稻菌素,,bsd,,2～10 μg/ml,,霉酚酸

33、,,gpt,,25 μg/ml,,嘌呤霉素,,乙?；D(zhuǎn)移酶,,0.5～10 μg/ml,,Xyl-A,,ada,,4 μmol/L,,,?,選擇劑基因使用濃度氨甲喋呤dhfr－0.01～300 μmo,40,報(bào)告基因,,特點(diǎn),,使用與分析方法,,cat,,內(nèi)源活性低，蛋白穩(wěn)定，線性范圍窄，,體外，熒光或免疫分析,,lacZ,,有內(nèi)源活性，X-gal染色，線性范圍寬,,體內(nèi)外，染色，比色、化學(xué)發(fā)光或熒光分析,堿性磷酸酶,,分泌型，線性范圍寬，受到細(xì)胞類型限制,體外，比色、化學(xué)發(fā)光或熒光分析,gus,,蛋白質(zhì)穩(wěn)定，線性范圍寬，X-Gluc染色,體內(nèi)外，染色，比色、化學(xué)發(fā)光或熒光分析,gfp,,無(wú)內(nèi)

34、源活性，分子量小，穩(wěn)定，無(wú)需底物，紫外線激發(fā),體內(nèi)外，熒光分析,,,?,報(bào)告基因特點(diǎn)使用與分析方法cat內(nèi)源活性低，蛋白穩(wěn)定，線性范,41,第三節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的需求與培養(yǎng)基的制備,,動(dòng)物細(xì)胞離體后，失去了消化等系統(tǒng)，不能利用多糖、蛋白質(zhì)等聚合程度高的化合物。,只能利用簡(jiǎn)單的單體化合物如單糖、氨基酸等，為了維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)，還必須添加維生素、無(wú)機(jī)鹽類、生長(zhǎng)類因子及激素、結(jié)合蛋白質(zhì)、貼附與伸展因子及其它附加成分等。,動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的要求高，不同細(xì)胞系的要求也不盡相同，培養(yǎng)基要盡可能與體內(nèi)生活條件接近。,,?,第三節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的需求與培養(yǎng)基的制備?,42,一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求,,1.

35、糖類,糖類是細(xì)胞主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，分解后釋放出能量ATP。,培養(yǎng)基中都必須添加葡萄糖，有時(shí)添加核糖等。,提高細(xì)胞生長(zhǎng)的碳源和能源，主要是葡萄糖和谷氨酰胺。,,?,一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求?,43,2. 氨基酸,氨基酸是蛋白質(zhì)和酶的組成單位。氨基酸還參與合成一些含氮化合物，核苷酸的四種嘌呤和嘧啶堿基、兒茶酚胺等含氮激素及神經(jīng)遞質(zhì)等。氨基酸可通過生糖或生酮途徑轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔蛑舅?，間接提供能量。,動(dòng)物細(xì)胞：8－10種必須氨基酸。,離體容易失去，20種氨基酸中至少12種是必需氨基酸：,精氨酸、半胱氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸等。,谷氨酰胺還可作

36、為重要的碳源和能源而被利用。,,?,2. 氨基酸?,44,3. 維生素,維生素是一類微量的小分子有機(jī)生物活性物質(zhì)，對(duì)代謝和生長(zhǎng)起調(diào)節(jié)和控制作用。,水溶性維生素包括B族維生素和維生素C。B族維生素以輔酶或輔基形式參與酶反應(yīng)，主要調(diào)節(jié)酶活性和代謝活性。維生素C，抗壞血酸，在體內(nèi)參與還原反應(yīng)、羥化反應(yīng)，促進(jìn)膠原蛋白合成和粘多糖合成，抗氧化作用。,脂溶性維生素包括維生素A、D、E、K四種。,維生素A維持正常視覺和上皮組織。維生素D為視固醇類化合物，主要是調(diào)節(jié)鈣磷代謝。維生素E即生育酚，是抗氧化劑，防止生物膜中磷脂的不飽和脂肪酸被氧化。維生素K，促進(jìn)合成凝血酶原，促進(jìn)血液凝固。,,?,3. 維生素?,4

37、5,5. 無(wú)機(jī)鹽類,無(wú)機(jī)鹽是細(xì)胞代謝所需的酶的輔基，同時(shí)保持細(xì)胞的滲透壓和緩沖pH的變化。,Na,＋,和Cl,－,參與生理電活動(dòng)，維持水平衡、保持滲透壓和酸堿平衡。離體培養(yǎng)為細(xì)胞提供足夠的Na和Cl離子是基本條件，一般生理鹽水的離子濃度（0.9% NaCl）。,Ca,2＋,、Mg,2＋,，對(duì)細(xì)胞間的互黏穩(wěn)定起重要作用。在離體培養(yǎng)時(shí)，螯合細(xì)胞間的Ca,2＋,和Mg,2＋,，可以達(dá)到分散細(xì)胞的目的。,磷是核酸、磷脂等的組成成分。,碳酸鹽緩沖液是重要的體內(nèi)緩沖體系，與K,＋,、Cl,－,等在維持酸堿平衡具有重要作用。,,?,5. 無(wú)機(jī)鹽類?,46,6. 生長(zhǎng)類因子及激素,細(xì)胞之間是相互聯(lián)系的，而非孤

38、立的。特別是高度分化功能的動(dòng)物細(xì)胞更是如此。,細(xì)胞離體生長(zhǎng)時(shí)，必要添加激素與細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。胰島素是最常用的激素，促進(jìn)糖原和脂肪酸的合成，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有刺激作用。其它激素有促卵泡激素、甲狀腺素、乳激素、生育酚等。,細(xì)胞因子有表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，根據(jù)不同細(xì)胞添加。,為了細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)，必需添加貼附因子，纖維結(jié)合蛋白、膠原等，伸展因子如表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞因子等。,,?,6. 生長(zhǎng)類因子及激素 ?,47,二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境需求,1. 水與滲透壓,細(xì)胞生長(zhǎng)離不開水，水是細(xì)胞反應(yīng)的重要介質(zhì)。1）水是一種良好的溶媒，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在水中被吸收，廢物在水中被排泄。2）具有

39、熱穩(wěn)定性和導(dǎo)熱性，調(diào)節(jié)穩(wěn)定溫度。,正常血漿滲透壓主要是無(wú)機(jī)鹽Na,＋,、K,＋,、Cl,－,、HCO,3,－,等構(gòu)成，蛋白質(zhì)構(gòu)成膠體滲透壓較小。,動(dòng)物細(xì)胞對(duì)滲透壓有較強(qiáng)的耐受性，常用增減NaCl的濃度調(diào)整滲透壓，每增加1mg/ml NaCl，滲透壓增加32 mOsm/kg。,離體培養(yǎng)細(xì)胞的滲透壓應(yīng)控制為等滲透溶液。,,?,二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境需求?,48,2. 溫度,不同種類的動(dòng)物細(xì)胞對(duì)溫度的要求是不同的，變溫動(dòng)物對(duì)溫度要求沒有恒溫動(dòng)物嚴(yán)格。,哺乳動(dòng)物細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度為37,℃，雞細(xì)胞為39－40℃，而昆蟲類細(xì)胞為25－28℃。,在培養(yǎng)過程中，根據(jù)細(xì)胞種類選擇確定適宜的培養(yǎng)溫度。,哺乳動(dòng)物細(xì)

40、胞的耐受溫度范圍較窄，在,35-37,℃內(nèi)能正常進(jìn)行代謝和生長(zhǎng)，超出范圍會(huì)引起細(xì)胞傷害甚至死亡。,細(xì)胞對(duì)低溫的耐受性比高溫要強(qiáng)，低溫抑制生長(zhǎng)，但無(wú)傷害作用，在冰點(diǎn)溫度附近仍能存活。,,?,2. 溫度?,49,3. 氧氣,動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)必須有氧氣，無(wú)氧下，能獲得能量供應(yīng)，但細(xì)胞缺氧時(shí)不能生存。離體培養(yǎng)的氣體含有5％CO,2,和95％空氣，其中氧濃度為21％。有時(shí)充以N,2,氣稀釋O,2,濃度。O,2,濃度在60%以上為高氧環(huán)境，對(duì)細(xì)胞毒性較大。,4. pH值,動(dòng)物細(xì)胞對(duì)pH值很敏感，低于6.8或超過7.6會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響。機(jī)體細(xì)胞的pH范圍為6－8，血液和體液中，變化范圍很小。人血液pH維持7.36

41、-7.44。pH低于7.05會(huì)發(fā)生酸中毒，高于7.45發(fā)生堿中毒。細(xì)胞代謝產(chǎn)生CO,2,，使培養(yǎng)液變酸，pH發(fā)生波動(dòng)。合成培養(yǎng)基偏酸性，為了穩(wěn)定pH，可用緩沖體系配制。在開放體系中，CO,2,逸出，使培養(yǎng)基變堿。通入5％CO,2,，可維持在pH7.2-7.4范圍內(nèi)。,,?,3. 氧氣?,50,5. 生長(zhǎng)基質(zhì),改變生長(zhǎng)表面特性，促進(jìn)細(xì)胞貼附的物質(zhì)。,貼附細(xì)胞生長(zhǎng)需要一個(gè)支持介質(zhì)，采用在培養(yǎng)液中添加或在器皿表面覆蓋生長(zhǎng)基質(zhì)，幫助細(xì)胞的貼附和生長(zhǎng)。,生長(zhǎng)基質(zhì)為胞外基質(zhì)成分，多聚賴氨酸、纖維連接蛋白、膠原、層黏蛋白、韌黏素等。,生長(zhǎng)基質(zhì)已有商業(yè)化產(chǎn)品，,用PBS或BBS配成10倍貯存液，在37,℃下包

42、被，靜置2－4小時(shí)或室溫過夜，對(duì)器皿表面進(jìn)行包被，然后無(wú)菌生理鹽水洗滌后使用。有些還可以直接加入培養(yǎng)液。,,?,5. 生長(zhǎng)基質(zhì)?,51,生長(zhǎng)基質(zhì),,貯存液濃度,,使用濃度,,使用方法,,多聚賴氨酸,,0.5 mg/L,,0.05 mg/L,,表面包被,,纖維連接蛋白,,10 mg/ml,,1 mg/ml,,加入培養(yǎng)液,,層粘蛋白,,,,5～10 μg/ml,,表面包被,,韌粘素,,75 μg/ml,,5～15 μg/ml,,包被或加入培養(yǎng)液,,膠原蛋白,,1～3 mg/ml,,0.1 mg/ml,,表面包被,,,?,生長(zhǎng)基質(zhì)貯存液濃度使用濃度使用方法多聚賴氨酸0.5 mg/L,52,6．抗生素

43、,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，由于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，很容易被微生物污染。雖然對(duì)使用抗生素仍存在質(zhì)疑，但還是常添加抗生素，以避免輕度污染。,抗生素使用濃度差別很大，一般范圍為50～100 μg/ml。在大規(guī)模生產(chǎn)中，除了青霉素和β-內(nèi)酰胺類抗生素外，其它抗生素可以使用。,抗生素使用對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒性，而且使實(shí)驗(yàn)室保留抗藥性微生物，應(yīng)加以注意和克服。,,,?,6．抗生素?,53,抗生素,,作用對(duì)象,,工作濃度（μg/ml）,,穩(wěn)定性（天）,,兩性霉素B,,真菌,,1～2.5,,3,,制霉菌素,,真菌,,50,,3,,氨芐青霉素,,G,＋,、G,－,細(xì)菌,,100,,3,,紅霉素,,G,＋,細(xì)菌，支原體,,10

44、0,,3,,四環(huán)素,,G,＋,、G,－,細(xì)菌，支原體,,10,,4,,慶大霉素,,G,＋,、G,－,細(xì)菌，支原體,,50,,5,,利福平,,G,＋,、G,－,細(xì)菌,,50,,3,,卡那霉素,,G,＋,、G,－,細(xì)菌,,100,,5,,鏈霉素,,G,＋,、G,－,細(xì)菌,,100,,3,,氯霉素,,G,－,細(xì)菌,,5,,5,,青霉素G,,G,＋,細(xì)菌,,100,,3,,,?,抗生素作用對(duì)象工作濃度（μg/ml）穩(wěn)定性（天）兩性霉素B真,54,三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類與組成,動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求高，不同細(xì)胞系的要求也不盡相同，因此培養(yǎng)基成分復(fù)雜而且昂貴。但是要盡可能提供與體內(nèi)生活條件接近的培養(yǎng)環(huán)境

45、。主要組成成分如下：,糖類、必需氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽類、生長(zhǎng)類因子及激素、結(jié)合蛋白質(zhì)、貼附與伸展因子及其它附加成分等。,不同細(xì)胞對(duì)葡萄糖利用相似，但對(duì)氨基酸的利用相差很大，不同的細(xì)胞過程對(duì)氨基酸的需求存在差別。目前停留在流加谷氨酰胺上,。,,,?,三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類與組成?,55,血清：蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素和生長(zhǎng)因子等。胎牛血清、新生?；虺膳Ｑ濉ⅠR血清、雞血清、羊血清及人血清，最廣泛應(yīng)用的為胎牛血清和新生牛血清。水解乳蛋白和膠原富含氨基酸。血清和水解酪蛋白應(yīng)用于許多細(xì)胞系和原代及傳代細(xì)胞培養(yǎng)。,脂類化合物對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是必需的，實(shí)際中類脂及其前體和血清常平行使用。添加的蛋白質(zhì)

46、試劑主要有鐵傳遞蛋白，起離子載體的作用，有時(shí)用無(wú)機(jī)鐵鹽代替。胰島素起生長(zhǎng)素的作用，白蛋白起保護(hù)劑作用。其他附加成分如核苷類及丙酮酸鹽等是培養(yǎng)基的必需成分，有助于細(xì)胞克隆和特異化細(xì)胞的培養(yǎng)。,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，被微生物污染。常添加抗生素，以避免輕度污染。,,?,血清：蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素和生長(zhǎng)因子等。胎牛血清、新,56,1. 天然培養(yǎng)基,直接取自于動(dòng)物組織提取液或體液作為培養(yǎng)基，如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，成分復(fù)雜，不穩(wěn)定，來源受到限制，不宜大量培養(yǎng)和生產(chǎn)使用。,2. 合成培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基用化學(xué)成分明確的試劑配制的培養(yǎng)基，組分穩(wěn)定?，F(xiàn)在已有幾十種合成培養(yǎng)基，大

47、部分已商品化。,組成：無(wú)機(jī)鹽、糖、氨基酸、維生素及其他成分。,由于細(xì)胞種類和培養(yǎng)條件不同，所用合成培養(yǎng)基也不同，在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中最常用培養(yǎng)基有7－8種。,,?,1. 天然培養(yǎng)基?,57,3. 無(wú)血清培養(yǎng)基,無(wú)血清培養(yǎng)基是全部用已知成分組配的、不加血清的合成培養(yǎng)基。在含有營(yíng)養(yǎng)和貼壁因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入適宜的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，細(xì)胞良好生長(zhǎng)，適合于制藥生產(chǎn)。,無(wú)血清培養(yǎng)基提高了培養(yǎng)的質(zhì)量，避免了使用血清帶來的麻煩，產(chǎn)品純化容易，組分穩(wěn)定，可大量配制。,無(wú)血清培養(yǎng)基通常需要添加激素與生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白、貼壁與伸展因子、低分子營(yíng)養(yǎng)成分等。,大多數(shù)無(wú)血清培養(yǎng)基含有蛋白質(zhì)和激素等大分子物質(zhì)，適宜于多種細(xì)胞系

48、的培養(yǎng)。對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)用的無(wú)血清培養(yǎng)基，往往成分不完全清楚，但簡(jiǎn)單而且低成本。,,?,3. 無(wú)血清培養(yǎng)基?,58,四、培養(yǎng)基的控制,1. 培養(yǎng)用水質(zhì),細(xì)胞培養(yǎng)水質(zhì)最低要求電導(dǎo)率在1X10,6,Ω cm以上。水存放時(shí)間不宜超過2周。對(duì)于制藥，必需使用純凈水配制培養(yǎng)基，普通水必需除去各類元素有毒或有害物質(zhì)及微生物，還必需除熱源，達(dá)到純凈水標(biāo)準(zhǔn)。,2. 緩沖液,緩沖液：弱酸與弱酸鹽或弱堿與弱堿鹽組成的，pH恒定但不干擾試驗(yàn)。不同種類細(xì)胞對(duì)pH 要求不一致，不同生長(zhǎng)階段對(duì)pH要求也不同。原代細(xì)胞pH要求嚴(yán)格，而傳代細(xì)胞要求較寬。細(xì)胞培養(yǎng)過程中代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使培養(yǎng)基的pH不斷下降。緩沖液中和培養(yǎng)液中

49、的酸性物質(zhì)。,,?,四、培養(yǎng)基的控制?,59,最廣泛使用為碳酸氫鈉/碳酸,其次為磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉，調(diào)節(jié)二者的比例，配制成不同pH緩沖液。,碳酸鹽緩沖液除了直接的緩沖作用外，還有間接作用，碳酸生成揮發(fā)性CO,2,后很快逸出。細(xì)胞呼吸產(chǎn)生的CO,2,與水形成碳酸，任何堿在培養(yǎng)液中都被中和，生產(chǎn)相應(yīng)碳酸氫鹽,其他緩沖液:Tricine-Glycine、MOPS 、TES 、HEPES 、DIPSO 、HEPPSO 等等有機(jī)緩沖液，緩沖能力強(qiáng)。Tris所含氨基具有高的化學(xué)反應(yīng)活性，能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，并通過生物膜，它調(diào)節(jié)pH要依賴于溫度的變化，因此不宜作為培養(yǎng)液。離體培養(yǎng)中，緩沖液多為平衡鹽溶液的重

50、要組分之一，很少單純使用。,,?,最廣泛使用為碳酸氫鈉/碳酸,其次為磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉，調(diào),60,3. 生理鹽水與平衡鹽溶液,在緩沖液的基礎(chǔ)上，添加調(diào)節(jié)滲透壓的鹽類，在一定程度上能滿足細(xì)胞對(duì)pH和鹽離子要求。,緩沖液或緩沖鹽溶液用于:配制溶液, 處理細(xì)胞的溶液。對(duì)于直接接觸、長(zhǎng)期培養(yǎng)的培養(yǎng)液，常用生理鹽水和平衡鹽溶液，是滲透壓與胞漿滲透壓平衡的溶液。,生理鹽水供給細(xì)胞水分和各種離子，維持一定滲透壓，并能良好溶解試劑和藥物。有各種不同成分的生理鹽水，分別加入pH緩沖劑與指示劑、葡萄糖，形成平衡鹽溶液。,平衡鹽溶液：集緩沖液的緩沖能力、生理鹽水的等滲能力、營(yíng)養(yǎng)供給為一體，具有多種功能和作用。,

51、,?,3. 生理鹽水與平衡鹽溶液?,61,BSS配制：,1）先分別溶解CaCl,2,、MgCl,2,、MgSO,4,。,2）在另一容器中依次溶解其他試劑。,3）在另一容器中用5.6% NaHCO,3,數(shù)滴溶解酚紅。,4）將含Ca,2+,、Mg,2+,溶液緩慢倒入步驟2配制的溶液中，攪拌，防止沉淀。,5）再加入酚紅溶液。,6）補(bǔ)足水，并用NaHCO,3,調(diào)節(jié)pH。,含葡萄糖的BSS過濾除菌，不含葡萄糖時(shí)常規(guī)高壓滅菌。小量培養(yǎng)液可置4度保存。一旦出現(xiàn)沉淀，要重新配制。,,?,BSS配制：?,62,注意事項(xiàng)：,細(xì)胞只利用L型氨基酸，不能利用D型，對(duì)于DL混合型氨基酸，使用量應(yīng)該加倍。,谷氨酰胺溶液中

52、很不穩(wěn)定，要單獨(dú)配制成濃縮液。,NaHCO,3,一般配成3.7％、5.6%、7.4%三種濃度，過濾除菌或高壓滅菌，4度保存，使用前加入，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH。,為了優(yōu)化細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，還添加其他成分，如嘌呤和嘧啶類，維生素C、谷胱甘肽、巰基乙醇。,一般情況下，培養(yǎng)基成分如氨基酸、維生素、葡萄糖、緩沖液等、補(bǔ)充因子幾類，先配制成高倍濃縮的母液，過濾滅菌，冷藏。使用時(shí)按一定比例稀釋，配制成工作液。,,?,注意事項(xiàng)：?,63,第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)過程,一、單細(xì)胞生長(zhǎng)增殖周期,從一個(gè)細(xì)胞分裂形成兩個(gè)新細(xì)胞的過程為一個(gè)細(xì)胞周期或一個(gè)細(xì)胞世代。單個(gè)細(xì)胞周期包括細(xì)胞間期、細(xì)胞分裂期，間期又包括間期1、D

53、NA合成期和間期2三個(gè)時(shí)期。,不同的細(xì)胞類型其分裂周期及各期的時(shí)間都不同，培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成分也會(huì)影響細(xì)胞周期,,,一般地動(dòng)物細(xì)胞分裂周期為,12,－,48,小時(shí),,,典型的細(xì)胞周期為,24,小時(shí)。,對(duì)連續(xù)細(xì)胞系，失去了細(xì)胞周期控制，人工培養(yǎng)條件不適，細(xì)胞將發(fā)生程序化死亡即凋亡。在培養(yǎng)過程中，缺乏生長(zhǎng)因子或血清、營(yíng)養(yǎng)受限和逆境等可引發(fā)凋亡發(fā)生。,,,?,第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)過程?,64,二、細(xì)胞群體的生長(zhǎng)過程,細(xì)胞群體生長(zhǎng)增殖過程與微生物的生長(zhǎng)增殖過程相似,1. 潛伏期，細(xì)胞經(jīng)歷一段懸浮狀態(tài)，貼附于器皿表面。,2. 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞分裂旺盛，指數(shù)增加。細(xì)胞相互接觸匯合成片，接觸抑制

54、，限制分裂和運(yùn)動(dòng)，密度不再增加。,3. 靜止期 ：分裂數(shù)與死亡數(shù)相等的相對(duì)動(dòng)態(tài)平衡時(shí)期。,4.衰亡期：細(xì)胞死亡數(shù)目大于分裂數(shù)目的時(shí)期。,三、群體細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù),細(xì)胞分裂代數(shù)G就可用下列公式計(jì)算：,G＝logN－logN0）/log2,,?,二、細(xì)胞群體的生長(zhǎng)過程?,65,第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的分離與培養(yǎng),一、細(xì)胞的種類,生物體是由多種多樣的分化細(xì)胞構(gòu)成，如人體的細(xì)胞類型達(dá)200余種。,這些細(xì)胞都是由受精卵分裂產(chǎn)生的細(xì)胞后代生長(zhǎng)增殖分化而來。不同細(xì)胞具有不同的功能，細(xì)胞分化異常導(dǎo)致癌變。分化程度越高，脫分化的能力越差。,在胚胎發(fā)育過程中，高等動(dòng)物細(xì)胞的分化是由全能性變成多能性，再變成單能性，進(jìn)

55、而失去再分化的能力。,雖然成熟細(xì)胞不能再分化，但其細(xì)胞核仍然具有全能性，因此可以通過核移植，克隆動(dòng)物。,,?,第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的分離與培養(yǎng)?,66,體外培養(yǎng)細(xì)胞，可分為原代細(xì)胞系、傳代細(xì)胞。,原代培養(yǎng)：,從體內(nèi)取出的組織細(xì)胞進(jìn)行體外接種培養(yǎng)，原代培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞，它生長(zhǎng)分裂并不旺盛，與體內(nèi)細(xì)胞相似，適合于藥物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。生產(chǎn)中有些產(chǎn)品仍沿用原代細(xì)胞，如雞胚細(xì)胞，兔或鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞。,傳代細(xì)胞:,原代細(xì)胞轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)的細(xì)胞。傳代后，細(xì)胞分裂增殖旺盛，能保持一致的二倍體核型，所以又成為二倍體細(xì)胞系。傳代細(xì)胞的增殖能力有限，所以也稱為有限細(xì)胞系。如WI－38、MRC－5、2BS等用于生產(chǎn)。,,?

56、,體外培養(yǎng)細(xì)胞，可分為原代細(xì)胞系、傳代細(xì)胞。?,67,根據(jù)細(xì)胞的傳代次數(shù)和壽命，可分為有限細(xì)胞系和無(wú)限細(xì)胞系或連續(xù)細(xì)胞系。,有限細(xì)胞系:正常細(xì)胞經(jīng)過多次傳代后，一般可連續(xù)培養(yǎng)30－50代，就會(huì)逐漸失去增殖能力，也就是說它們只能生長(zhǎng)有限的時(shí)間，經(jīng)過若干傳代培養(yǎng)后將老化死亡。,無(wú)限細(xì)胞系：當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過自然或人為的因素轉(zhuǎn)化為異倍體后，才能變?yōu)闊o(wú)限細(xì)胞系。如腫瘤細(xì)胞就是自發(fā)形成的永久細(xì)胞系，沒有分裂次數(shù)的限制。物理、化學(xué)或生物因素也能獲得。,細(xì)胞壽命無(wú)限，生長(zhǎng)不受細(xì)胞密度的影響，倍增時(shí)間短不具接觸抑制現(xiàn)象，它對(duì)培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)因子等要求低，，非常適合于工業(yè)化生產(chǎn)，理想的藥物生產(chǎn)細(xì)胞系。,,?,根據(jù)細(xì)胞的傳

57、代次數(shù)和壽命，可分為有限細(xì)胞系和無(wú)限細(xì)胞系或連續(xù),68,根據(jù)細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)特性和對(duì)基質(zhì)的依賴性，可分為貼壁依賴性細(xì)胞和非貼壁依賴性細(xì)胞。,貼壁依賴性細(xì)胞：生長(zhǎng)需要在適量帶電荷的固體或半固體支持表面，細(xì)胞自身分泌或人為在培養(yǎng)基中加入貼附因子，使細(xì)胞依附在支持物表面，才能生長(zhǎng)和增殖，大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞都屬于此類。,非貼壁依賴性細(xì)胞：生長(zhǎng)不依賴于固體支持物表面，可在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)，有時(shí)被稱為懸浮細(xì)胞。血液、淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞屬于此類，生長(zhǎng)干擾素的Namalwa細(xì)胞。,有些細(xì)胞對(duì)支持物的依賴性不嚴(yán)格，可貼壁生長(zhǎng)，可懸浮生長(zhǎng)。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、小鼠L929細(xì)胞、BHK細(xì)胞。,,?,根據(jù)細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)

58、特性和對(duì)基質(zhì)的依賴性，可分為貼壁依賴性細(xì)胞和非,69,二、工程細(xì)胞的獲得與保存,目前用于制藥的動(dòng)物細(xì)胞有4類，即原代細(xì)胞系、二倍體細(xì)胞系、異倍體細(xì)胞系和融合的或重組的工程細(xì)胞系。,細(xì)胞無(wú)限傳代，使大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)藥物成為可能。,異倍體細(xì)胞用于產(chǎn)生重組基因工程產(chǎn)品，使動(dòng)物細(xì)胞成為藥物生產(chǎn)的一個(gè)新領(lǐng)域。,,?,二、工程細(xì)胞的獲得與保存?,70,1. 原代細(xì)胞系的分離與培養(yǎng),用原代細(xì)胞系生產(chǎn)藥物需要大量的動(dòng)物。,動(dòng)物組織或器官,洗滌 粉碎,酶解消化,離心或過濾,接種培養(yǎng),培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞,洗 滌,37度消化，檢查是否充分和完全。,胰蛋白酶：細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，胚胎、肝、腎及傳代細(xì)胞,膠原酶：纖維、上

59、皮、癌組織,工作濃度：0.1-0.3 mg/ml,鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶,,?,1. 原代細(xì)胞系的分離與培養(yǎng)動(dòng)物組織或器官洗滌 粉碎酶解消化,71,2. 傳代細(xì)胞培養(yǎng),長(zhǎng)滿器皿表面的細(xì)胞進(jìn)行分離，接種到新的培養(yǎng)基上，進(jìn)行新一輪培養(yǎng)。,掌握好最佳時(shí)期：剛剛?cè)繀R合的細(xì)胞，過早產(chǎn)量低，過晚健康狀態(tài)不佳。,過程與原代細(xì)胞相同，用30－50倍體的0.25％胰蛋白酶和EDTA對(duì)細(xì)胞塊消化，消化后再培養(yǎng)。,要注意消化程度，細(xì)胞對(duì)酶的反應(yīng)不同，有的敏感，掌握好適宜的消化時(shí)間和方法，不要過度，獲得細(xì)胞濃度均勻，生長(zhǎng)速度一致的傳代細(xì)胞。,曾經(jīng)廣泛應(yīng)用，但不是理想的生產(chǎn)細(xì)胞系,,?,2. 傳代細(xì)胞培養(yǎng)?,7

60、2,3. 細(xì)胞系的建立與保存,一旦獲得了穩(wěn)定的有一定特性的細(xì)胞系，就建立細(xì)胞庫(kù)，進(jìn)行長(zhǎng)期保存。根據(jù)藥品生產(chǎn)的有關(guān)規(guī)定，必須建立原始細(xì)胞庫(kù)和生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)或工作細(xì)胞庫(kù)。,,,WCB1,QC,,WCB2,QC,QC,原始培養(yǎng)物,MCB,,QC內(nèi)容：細(xì)胞活性檢測(cè)、無(wú)菌實(shí)驗(yàn)、核型、,DNA,分析、同工酶分析、支原體試驗(yàn)、其他外源物試驗(yàn)、穩(wěn)定性和基因型分析等，工作細(xì)胞庫(kù)必須與主細(xì)胞庫(kù)完全一致。,,,?,3. 細(xì)胞系的建立與保存WCB1QCWCB2QCQC原始培養(yǎng),73,低溫冷凍保存：,用冷凍保護(hù)液（含10％血清的培養(yǎng)液，附加10％甘油或7.5%-10%二甲基亞砜）細(xì)胞預(yù)冷，稀釋成10,6,細(xì)胞/ml。分裝

61、，火焰下封口。緩慢冷凍，細(xì)胞放入CO,2,低溫冰柜或液氮中，溫度為-150—-190,℃,，細(xì)胞的全部活動(dòng)幾乎處于停止?fàn)顟B(tài)。,復(fù)蘇細(xì)胞：,冷凍細(xì)胞取出，立即在37,℃,水浴中，快速融化。在保護(hù)劑存在下，慢凍快融是保存復(fù)蘇細(xì)胞的要領(lǐng)。融化后的細(xì)胞可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。,,?,低溫冷凍保存：?,74,三、大規(guī)模培養(yǎng)方法,根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)，只能采用懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)等三種主要方法進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。,1. 單層貼壁培養(yǎng),細(xì)胞貼附于一定的固體支持表面上，進(jìn)行的培養(yǎng)方法。大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞屬于貼壁依賴性，貼壁培養(yǎng)是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的一種重要方法。接種后，細(xì)胞經(jīng)過吸附、接觸而,貼附于基質(zhì)表面，然后進(jìn)行,

62、生長(zhǎng)、分裂繁殖，很快進(jìn)入對(duì)數(shù)期。一般數(shù)天就長(zhǎng)滿整個(gè)表面，形成致密的單層細(xì)胞。,貼壁培養(yǎng)容器:轉(zhuǎn)瓶、玻璃珠、微載體和中空纖維等。,滾瓶是為早期培養(yǎng)所采用，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，投資少，重復(fù)性好，但勞動(dòng)強(qiáng)度大，占用空間大，產(chǎn)量低，不易控制和監(jiān)測(cè)。,,?,三、大規(guī)模培養(yǎng)方法?,75,細(xì)胞貼壁原理：,細(xì)胞主要靠靜電引力和范德華力貼附在固體表面，因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞在生理狀態(tài)下帶負(fù)電，貼壁培養(yǎng)的固體表面要求具有正電荷和高表面活性。,適宜的電荷密度是粘附和貼壁的關(guān)鍵，電荷密度低，不能有效粘附，電荷密度高則會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。,優(yōu)點(diǎn)：容易更換培養(yǎng)液，灌注培養(yǎng)時(shí)，能達(dá)到高細(xì)胞密度；有利于產(chǎn)物的分泌表達(dá)，可改變培養(yǎng)液與細(xì)胞的比例。,

63、缺點(diǎn)：操作較煩雜，檢測(cè)受到一定限制，培養(yǎng)條件難以均一，傳質(zhì)和傳氧差，放大培養(yǎng)是瓶頸。,,,?,細(xì)胞貼壁原理：?,76,2．微載體培養(yǎng),微載體為三維培養(yǎng)系統(tǒng)，細(xì)胞貼附于微載體上伸展和增殖，再懸浮于培養(yǎng)液中。,微載體培養(yǎng)兼具貼壁和懸浮培養(yǎng)的雙重優(yōu)點(diǎn)，有很大的比表面積，供單層細(xì)胞貼附和增殖。,懸浮微球使細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境均一，培養(yǎng)基利用率高，重復(fù)性好，減少了勞動(dòng)強(qiáng)度，容易放大，于20世紀(jì)80年代正式用于工業(yè)化生產(chǎn)干擾素、疫苗和尿激酶原等。,多孔微載體或多孔微球，極大地增加了比表面積，如Cytodex-1的比表面積達(dá)6000 cm,2,/g，Cytopore的比表面積達(dá)28000 cm,2,/g。商品化的

64、微載體基質(zhì)有玻璃、葡聚糖、纖維素、塑料和明膠等，表面帶電基團(tuán)為DEAE等。,,?,2．微載體培養(yǎng)?,77,玻璃珠：直徑約,2,～,3 μm,，密度,1.5 g/cm,3,，難以在低速下懸浮。在玻璃表面覆蓋塑料，可得到低密度微載體，如,Bioglas,和,Ventreglas,，而中空玻璃也可達(dá)到此密度。,葡聚糖微載體：帶正電，干粉可在,pH7.2,的磷酸鹽緩沖液中吸脹，清洗滅菌后使用。,Cytodex 2：,電荷性大大下降，吸附能力很低，適合于蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)。,纖維素微載體,DE52,和,DE53：,適合多種細(xì)胞培養(yǎng)。,塑料載體,Biosilon,是聚乙烯載體，無(wú)吸附性能，可重復(fù)使用，但貼壁

65、較慢，對(duì)細(xì)胞的摩擦損傷較大。,聚丙烯酰胺載體貼壁較快，親水性。,,?,玻璃珠：直徑約2～3 μm，密度1.5 g/cm3，難以在低,78,微載體的選擇依賴于攪拌系統(tǒng)和工藝過程，可用于轉(zhuǎn)瓶、攪拌燒瓶和氣升式反應(yīng)器等。,為了提高貼壁能力，對(duì)基質(zhì)表面進(jìn)行包埋，如血清蛋白、多聚賴氨酸處理，可加速貼壁過程。,在懸浮培養(yǎng)早期，還可向培養(yǎng)液補(bǔ)充丙酮酸、腺嘌呤、次黃嘌呤、胸腺嘧啶等。,,,?,微載體的選擇依賴于攪拌系統(tǒng)和工藝過程，可用于轉(zhuǎn)瓶、攪拌燒瓶和,79,多孔微載體：,直徑,0.2,～,5 mm,，孔徑,20,～,300 μm,，達(dá)占總體積的,85%,，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的固定化，達(dá)到高密度培養(yǎng)。,廣泛使用的多孔

66、微載體有,Cellsnow,、,Cytocell,（纖維素基質(zhì)）、,Verax,、,Cultisphere,（膠原）、,Cytoline 1,和,2,（聚苯乙烯）、,ImmobaSil,（硅橡膠）及,Siran,（玻璃）等。,主要用于攪拌反應(yīng)器、固定床和流化床反應(yīng)器。,,,?,多孔微載體：?,80,貼壁培養(yǎng)的固體表面要求：,正電荷和高度表面活性。玻璃、聚苯乙烯塑料、不銹鋼金屬材料和微載體、,多孔微載體或多孔微球。商品化的微球基質(zhì)是葡聚糖、聚丙烯酰胺、明膠交聯(lián)、聚苯乙烯和纖維素等，帶電基團(tuán)為DEAE等。微載體有CytodexI、II、III和 DEAE－纖維素等，已是主要的培養(yǎng)方法。,理想的微載體所具備的性能：,質(zhì)地柔軟，微球間摩擦輕；耐高溫，可高壓滅菌；透明性，便于觀察細(xì)胞生長(zhǎng)；細(xì)胞相容性，利于貼附和生長(zhǎng)；無(wú)毒性和惰性，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害，不產(chǎn)生有害物質(zhì)，不吸附培養(yǎng)基；低速即懸浮，靜止即沉降，便于換液和收獲；微粒大小均勻；可回收重復(fù)使用。,,?,貼壁培養(yǎng)的固體表面要求：?,81,3. 懸浮培養(yǎng),細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)游離懸浮生長(zhǎng)的培養(yǎng)過程,主要對(duì)于非貼壁性依賴性細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞等。,動(dòng)物細(xì)胞懸浮培